检测频率调制 (FM) 的方向对于动物和人类的声音交流至关重要。初级听觉皮层 (A1) 中神经元的方向选择性放电通常归因于前馈兴奋和抑制输入之间的时间偏移。然而，皮层循环电路如何参与这种计算仍不清楚。在这里，我们在清醒小鼠中使用双光子钙成像和全细胞记录来证明方向选择性不是由突触电流之间的时间偏移引起的，而是由首选方向和非首选方向之间总突触电荷的不对称引起的。皮层生长抑素表达中间神经元 (SOM 细胞) 的失活降低了方向选择性，揭示了其皮层贡献。我们的理论模型表明，电荷不对称是由于 SOM 细胞介导的抑制的宽阔空间拓扑引起的，这种抑制调节强循环电路中的信号放大。总之，我们的研究结果揭示了循环网络动态在塑造皮层对行为相关的复杂声音的调谐方面的主要贡献。

一、介绍

方向选择性是跨感觉模式的一种基本计算。例如，视觉皮层中的神经元选择性地对朝一个方向移动的物体做出反应，而体感皮层中的神经元则偏向胡须偏转的特定方向。在听觉系统中，神经元选择性地对向上或向下的频率调制 (FM) 发出信号，这为听觉引导行为（如回声定位和声音交流 ）提供了关键基础。揭示神经回路如何实现方向选择性发射是了解我们的大脑如何随着时间的推移整合信息以解释来自外部世界的动态感官输入的基本步骤。

几十年来，对各种感觉系统的方向选择性的研究产生了两种相互竞争的算法。一种模型提出了一种延迟线机制，其中受体场相邻部分的刺激会触发具有不同延迟的兴奋性输入，而第二种模型则提出非偏好的运动方向会引起前导抑制，从而抑制由尾随刺激触发的尖峰。尽管这些模型的突触机制不同，但它们的相似之处在于，它们都将方向选择性归因于前馈突触输入到整合神经元之间的时间偏移。与这些方向选择性的前馈机制相比，令人惊讶的是，人们对循环电路的作用知之甚少，而循环电路构成了感觉皮层中约 95% 的突触。对麻醉小鼠的研究报告称，皮层活动精确地遵循丘脑输入并线性乘以信号，这与循环电路在方向选择性中的主动计算作用相矛盾。因此，麻醉动物的听觉和视觉皮层的方向选择性被归因于上面描述的前馈机制或来自上游皮层下结构的遗传。

最近，许多针对清醒动物的研究挑战了前馈占主导地位的皮质操作观点，他们证明皮质作为抑制稳定网络 (ISN) 运行。ISN是一种电路操作模式，其中兴奋性复发足够强，除非通过反馈抑制来稳定，否则会破坏神经活动的稳定性，从而由于网络级相互作用而产生非线性甚至矛盾的皮质活动 。这些发现提出了一个问题，即复发性皮质回路是否仅仅遵循清醒状态下的丘脑输入，还是在塑造皮质对复杂感官刺激的调节方面发挥更积极的作用。在这里，我们结合双光子钙成像、全细胞记录和计算建模来剖析清醒小鼠初级听觉皮层 (A1) 神经元中 FM 方向选择性的电路机制。与经典模型相比，我们发现方向选择性不是由前馈突触输入之间的时间偏移引起的；而是由于循环电路中输入信号在首选方向和非首选方向之间的差异放大而产生的。这些结果表明，皮质对时间复杂感官刺激的调谐是由非线性循环网络动力学形成的，这一结论背离了前馈主导电路的经典思想。

二、结果

2.1 A1 神经元对与行为学相关的 FM 速率的扫描具有方向选择性

为了确定小鼠发声中使用的 FM 速率的行为学范围，我们首先记录了它们的通讯叫声。我们重点研究了三类发声——幼崽隔离叫声、雄性求偶歌曲和痛苦叫声，这些叫声具有不同的频谱-时间结构（图 1a，补充图 1）。我们 收集了C57BL /6J、BALB/ c和 CBA 小鼠的发声，因为不同品系小鼠的发声模式各异。我们发现这三类发声的绝对 FM 速率很少超过 40 oct/s（图 1b；幼崽叫声：2.3%；雄性歌曲：1.7%；痛苦叫声：1.4%）。幼崽叫声的 平均绝对FM 速率为 9.9 oct/s，雄性歌曲为 11.0 oct/s，痛苦叫声为 7.5 oct/s。这些数据表明，小鼠在进行交流时大多使用比之前许多研究中测试过的更慢的 FM 速率范围（30–90 oct/s 14、70 oct/s 8、15或 8–670 oct/s 34），这促使我们将实验重点放在这些具有行为学意义的 FM 速率上。

图 1.A1 神经元对与行为学相关的 FM 速率的扫描具有方向选择性。a左图为发声记录示意图。右上图为代表性发声的声谱图。右下图为直方图，显示 C57BL/6J 小鼠三种发声类别的 FM 速率使用概率，并与各个数据点叠加（n = 7、5、5 只小鼠，20,295、14,719、17,826 个幼崽、雄性和疼痛发声的声音轮廓片段；见补充数据 1）。结果为平均值±SEM。b上图为三个品系中三种发声类别的 FM 速率使用概率。底部，向上和向下扫描的使用概率（BALB：n = 8、3、3 只小鼠，4164、13,671、12,235 个声音轮廓片段；CBA：n = 4、3、3 只小鼠，21,658、11,314、25,640 个声音轮廓片段，分别用于幼崽、雄性和疼痛发声）。c左图，通过头骨成像的对叠加在皮质表面的纯音反应的内在信号成像。右图，A1 中 L2/3 神经元的体内双光子图像。在所有八只小鼠中均可重现观察到 A1 音调定位。d对三个代表性 L2/3 锥体细胞进行 FM 扫描调谐。轨迹是平均响应（五次试验）。底部的插图显示了频率与时间表示的示意图。DSI 的计算公式为 (U - D)/(U + D)，其中 U 和 D 分别代表向上和向下扫描触发的响应。e六种绝对 FM 速率下响应细胞的分数。（n = 8 只小鼠，1292 个细胞）。f每种FM 速率下绝对 DSI 的平均值（实线）和 SEM（阴影）（n = 8 只小鼠，205 个扫描响应细胞）。g两个代表性 A1 区域中 BF 和 DSI 的细胞水平空间组织。左图，通过玻璃窗成像的叠加在皮质血管上的固有信号图像。黄色方块表示双光子成像视野。右图显示成像锥体细胞位置、纯音的 BF 和 FM 扫描的 DSI。所有 FM 频率的平均锥体细胞h DSI 对其 BF 有很强的依赖性（n = 8 只小鼠，96 个细胞对扫描和纯音均有反应。R = − 0.403，p = 4.6 × 10 −5，双侧t检验）。红线为回归曲线。

接下来，我们通过在清醒头部固定小鼠中进行双光子钙成像来探究慢速 FM 扫描的方向如何编码在 A1 神经元中（图 1c）。为了确定 A1 的位置，使用三个频率（3、10 和 30 kHz）的纯音通过头骨进行内在信号成像，从而映射音调定位。我们注射了腺相关病毒 (AAV) 载体，在转基因小鼠的 A1 中表达钙指示剂 GCaMP6，其中 GABA 能中间神经元用 tdTomato（Vgat-IRES-Cre × ROSA-LSL-tdTomato）标记。这使我们能够从光学上区分谷氨酸能锥体细胞（绿色）和 GABA 能中间神经元（绿色 + 红色）。在病毒注射和在 A1 上植入玻璃窗两到三周后，我们在第 2/3 层（L2/3）进行了双光子钙成像，以测量单个神经元对 FM 扫描的反应。通过呈现各种速率（2.5–80 八度/秒，每个方向 6 个速率）的向上或向下扫描来确定 L2/3 锥体神经元的调谐特性。为了在具有广泛频率偏好的 A1 神经元中引起反应，以 70 dB SPL 呈现具有 4 个八度范围（4–64 kHz）的长 FM 扫描。总体而言，33% 的 GCaMP6s 表达锥体细胞（n = 1292 个细胞中的 429 个，8 只小鼠）在响应至少一个扫描刺激时增加了它们的活动（以 dF/F 测量），68% 的扫描反应神经元显示绝对方向选择指数 (DSI) 值大于 0.3。重要的是，即使在较慢的 FM 速率下，我们也观察到许多神经元也具有很强的方向选择性（图 1d），这与以前在麻醉啮齿动物中的研究形成了对比，这些研究报告称，对于低于 30 oct/s 15或 0.5 kHz/ms 35的扫描，神经元缺乏方向选择性。响应神经元的比例从快速到慢速 FM 扫描单调增加，这可能反映了慢速扫描传输的总声能较大（图 1e）。尽管如此，无论 FM 速率如何，绝对 DSI 值仍然很高（图 1f）；我们还通过单元记录证实了这一结果，发现与麻醉状态相比，清醒状态下的慢速 FM 扫描的方向选择性增强（补充图 2）。当将 DSI 与单个神经元的最佳频率 (BF) 进行比较时，我们发现锥体神经元 (图 1g、h ) 和 GABA 能神经元 (补充图 3 ) 中的 DSI 与 BF 呈负相关，A1 音调边缘的绝对 DSI 值较高。我们还注意到 DSI 值存在明显的局部异质性，并不严格遵循全局趋势。随着我们提高数据选择阈值，这种异质性变得不那么明显 (补充图 4))，表明反应较不强烈的细胞在 DSI 中表现出更大的变异性。这种对局部异质性的选择标准依赖让人联想到 A1 音调定位36中的选择标准依赖，因此它可能代表了该区域空间组织的一般规则。总之，这些结果表明，清醒状态下的 A1 神经元能够区分行为学相关速率的 FM 扫描方向。

2.2 方向选择性是由 FM 方向之间的兴奋性突触后电荷不对称引起的

为了直接确定形成方向选择性的突触后电流，我们接下来在清醒小鼠中进行了全细胞膜片钳记录（图 2a）。我们将记录吸量管对准 A1 的 L2/3，以内在信号成像确定的音调定位为指导。与我们之前的研究22一致，在清醒小鼠中的记录揭示了持续的高频自发 EPSC 和 IPSC 连珠，表明即使在没有传递声音的情况下皮质回路也高度活跃。有趣的是，慢速 FM 扫描的呈现持续引发自发 EPSC 和 IPSC 的长期抑制，这之前被称为“网络抑制” 22 , 37 （在图2b、c中用星号标记 ；在试验平均轨迹上，网络抑制表现为低于基线的慢电流）。网络抑制是对复发性活动的抑制，它由广泛的非首选频率引起；因此，当我们的 4 个八度 FM 扫描通过这些非首选频率时，会触发持续的网络抑制。除了网络抑制之外，首选 FM 扫描还会引起快速 EPSC（图 2b中的实心箭头和图2c中的橙色阴影区域 ），这与它们穿过神经元的音调感受场 (TRF) 所预期的一样。值得注意的是，非首选 FM 扫描触发的快速 EPSC 较小且通常无法检测到，尽管它们穿过了 TRF（图 2b-d）。方向之间电荷的不对称可能是神经元放电方向选择性的一个来源。为了量化非首选方向上突触电流的衰减，我们计算了兴奋性和抑制性突触后电荷的 DSI 值（DSI EPSC和 DSI IPSC）。在整个扫描速率范围内， 绝对 DSI EPSC都很高，并且与神经元放电的绝对值一致（图2e；见图 1f）。与快速 EPSC 类似，我们观察到快速 IPSC（图 2b中的空箭头和图2c中的紫色阴影区域 ）在非优先 FM 扫描中的强烈衰减，并且 DSI IPSC遵循与 DSI EPSC相同的趋势（图 2e、f ）。我们观察到 DSI EPSC和 DSI IPSC对单个神经元的 BF具有很强的依赖性（补充图 5），进一步证明了神经元放电方向选择性与突触后电荷之间的平行关系（图 1h）。

图 2.方向选择性是由 FM 方向之间声音诱发的突触后电荷的不对称引起的。a体内全细胞记录示意图。b不同速率的 FM 扫描引起的EPSC（左）和 IPSC（右）。轨迹是六次试验的平均值。红线表示声音的开始和结束。黑色箭头表示快速 EPSC。空箭头表示快速 IPSC。星号表示网络抑制。c在+20 oct/s（左）和 −20 oct/s（右）FM 扫描下，从 ( b ) 中放大的 EPSC 和IPSC。橙色（EPSC）和紫色（IPSC）阴影区域突出显示声音引起的快速突触后电流，这些电流仅在优先方向上突出。d 在每个绝对 FM 速率下对( b )中显示的细胞进行定量分析。左，快速突触后电流的总电荷。右，根据电荷计算的 DSI EPSC和 DSI IPSC。对于未触发突触后电流的速率，没有显示数据点。e DSI EPSC和 DSI IPSC跨细胞平均（EPSC，n = 5 只小鼠，9 个细胞；IPSC，n = 4 只小鼠，7 个细胞）。结果为平均值±SEM。f DSI EPSC和 DSI IPSC是相关的（R = 0.522；p = 0.0031，双侧t检验；n = 30 个细胞速率对，EPSC 和 IPSC 均具有 DSI 值）。红线为回归曲线。g时间偏移模型中优选和非优选 FM 扫描触发的 EPSC、IPSC 和尖峰的预测时间。虚线为 EPSC 的峰值时间。h在另一个代表性细胞中，由优选（10 oct/s；顶部）和非优选（-10 oct/s；底部）FM 扫描引起的 EPSC 和 IPSC。i （h）中灰色框内轨迹的放大视图。j EPSC 峰值先于 IPSC 峰值的时间在任一方向上与零没有显著差异（首选：n = 30 个细胞速率对，p = 0.976；非首选：n = 14，p = 0.800；首选与非首选：p = 0.817，双侧t检验）。红线表示平均值。k EPSC开始先于 IPSC 开始的时间在任一方向上与零没有显著差异（首选：p = 0.100；非首选：p = 0.549；首选与非首选：p = 0.153，双侧t检验）。

为了直接检验先前提出的 EPSC 和 IPSC 之间的时间偏移模型（图 2g），我们接下来量化了 FM 扫描期间 EPSC 和 IPSC 的相对时间（图 2h-k）。值得注意的是，无论我们测量的是峰值时间还是开始时间，我们都没有观察到首选方向和非首选方向之间 EPSC-IPSC 时间间隔的差异（首选与非首选，峰值：p = 0.817；开始：p = 0.153；图 2j，k）。EPSC-IPSC 时间间隔在两个测量中都聚集在零附近，表明兴奋和抑制的协方差。事实上，与时间偏移假设相反，IPSC 的开始时间往往领先于 EPSC 在首选方向上的开始时间（-3.5±2.0 毫秒，p = 0.100），这可能反映了 IPSC 的频率调谐范围比 EPSC 略广22 , 38。总之，这些发现反驳了前馈突触输入之间的时间偏移是 A1 中方向选择性的来源的观点；我们的结果表明，在清醒小鼠中，方向选择性是由扫描方向之间总突触后电荷的不对称性决定的。

2.3 SOM细胞在A1中形成方向选择性

非偏好方向上的兴奋性突触后输入衰减背后的电路机制是什么？先前对麻醉动物的研究表明，皮质会线性倍增丘脑输入，而突触后电荷中存在的方向选择性只是从丘脑遗传而来8、15 。或者，我们考虑了强烈复发的清醒皮质25进一步塑造 A1 中方向选择性的可能性。具体来说，我们专注于网络抑制的作用（抑制由非偏好音调触发的复发活动），因为其缓慢的动力学和 TRF 内的不对称性22使其适合于频率通道之间的方向相互作用（见下文）。由于网络抑制需要 SOM 细胞，但不需要 PV 细胞22，我们失活了这两种中间神经元亚型以检查它们对方向选择性的影响。我们使用病毒引入的视紫红质 (eNpHR3.0) 在头部固定的清醒小鼠的 A1 中进行了单元记录，并光灭活了 SOM (图 3a-c ) 或 PV (图 3d-f ) 细胞。我们使用弱 LED 强度来调节传输，而不会引起皮质活动状态的不可逆变化（参见“方法”）。值得注意的是，对首选 FM 扫描响应影响不大的 SOM 细胞光灭活显著增加了常规脉冲单元对非首选 FM 扫描的响应（图 3b、c和补充图 6a）。因此，与交错对照试验相比，LED 试验中的绝对 DSI 值显著降低（p = 0.0006；图 3g；快速脉冲单元见补充图 7a）。该结果支持 SOM 细胞在塑造听觉皮层内方向选择性方面的作用。

图 3.A1 中的 SOM 细胞形状方向选择性。a单元记录过程中 SOM 细胞光遗传学失活示意图。b有（琥珀色阴影和轨迹）和没有（黑色轨迹）SOM 细胞光失活的 FM 扫描响应。顶部，代表性规则尖峰单元中 FM 扫描响应的光栅图。底部，刺激前时间直方图 (PSTH)。对照和光刺激试验是交错的，但为了清楚起见在这里分开。灰色虚线表示声音的开始和结束。c ( b )中的 PSTH在减去声音之前的基线发放率后分别显示对照（顶部）和光刺激（底部）试验。d单元记录过程中 PV 细胞光遗传学失活示意图。e – f有和没有 PV 细胞光失活的 FM 扫描响应。g左，散点图显示对照和SOM细胞光失活试验期间的绝对 DSI。灰点显示所有扫描响应单元（n = 4 只小鼠，111 个规则脉冲单元中的 48 个）。斜直方图说明了 LED 下绝对 DSI 的变化（** p = 0.0006，双侧t检验）。右图为 PV 细胞光失活的相同图。n = 4 只小鼠，99 个规则脉冲单元中的 45 个。p = 0.667。虚线，统一线。h PV细胞和 SOM 细胞的光失活使自发放电率增加到相似的程度（n = 88 和 96 个规则脉冲单元，基线放电率 > 0.25 Hz；p = 0.669，双侧t检验）。箱线图显示中位数和第 25 和第 75 百分位数为箱线边缘，1.5 × 四分位距为晶须。

与 SOM 失活实验相反，我们没有观察到 PV 细胞光失活过程中绝对 DSI 的任何下降（图 3d-g和补充图 6b）。绝对 DSI 反而显示出略微增强的趋势，这可以通过先前报道的 PV 细胞光失活期间增强的网络抑制来解释22。SOM 和 PV 光失活效应之间的差异不能归因于不同水平的光遗传学操作，因为自发放电的增加在 SOM 和 PV 细胞光失活之间无法区分（p = 0.669；图 3h和补充图 7b）。总之，这些结果排除了 A1 中的方向选择性仅仅从皮层下系统遗传的可能性，并证明了 SOM 抑制神经元对皮层方向选择性的主动塑造。

2.4 ISN 模型解释了 A1 电路中 FM 扫描的非线性积分

我们的数据表明，FM 方向之间的兴奋性突触后电荷的不对称性在 A1 内增强，表明丘脑输入在皮质回路中呈现非线性放大。哪些电路特性使得这种计算成为可能，我们的结果与之前在麻醉动物身上的报告结果有何不同？为了研究这些核心问题，我们构建了 A1 的网络模型，以充分探索无法通过实验操作获得的回路和细胞参数。为此，我们建立了一个三群体网络模型，该模型结合了已知的跨神经元亚型（锥体、PV 和 SOM）的连接参数以及 A1 音调定位内的空间限制（图 4a和“方法”）。受过去在清醒小鼠的 A1 中进行的实验记录22、24的启发，我们将网络建模为ISN。为了简化分析，我们用动态发放率建模单个神经元活动，并沿着一维空间连续的音调拓扑组织神经元（图 4b）。虽然这种简化忽略了 DSI 分布的局部异质性（图 1h），但它旨在捕捉 DSI 对单个神经元首选频率依赖性的全局趋势。使用阈值线性发放率函数来防止发放率低于零（图 4c）。对 SOM 细胞的输入和输出都采取了空间上较宽的有效连接，而所有其他连接都设置为较窄22。我们将向上（向下）FM 扫描建模为行进的高斯脉冲，它始于音调拓扑中的低（高）频位置（补充影片 1）。我们假设丘脑输入的 DSI 为零（参见“讨论”）。总的来说，这种前馈丘脑输入激活了循环网络，该网络在时间上过滤并在空间上卷积活动以产生最终的皮质反应。

图 4.ISN 模型解释了 A1 电路中 FM 扫描的非线性积分。a三个细胞群之间局部连接的示意图。b显示群体之间连接的空间尺度的示意图。水平线显示一维空间连续的音调定位。c从输入电流到输出发放率的神经元传递函数。d前馈 EPSC （ i）、总 EPSC 的变化（ii）、PV 细胞的 IPSC 的变化（iii）、SOM 细胞的 IPSC 的变化（iv）和锥体细胞的发放率（v）的时间过程，BF 为 5 kHz。暗线代表 ±20 oct/s 的 FM 扫描刺激。e总结图显示了向上和向下方向之间兴奋性突触后电荷的差异扩增。幅度已标准化为前馈 EPSC 的幅度。f以 ±20 oct/s FM 速率绘制 DSI 与BF。BF = 5 kHz 的数据点显示为红点。g绝对DSI 与绝对 FM 速率的关系。

有了这个模型，我们首先考虑 20 oct/s 的向上 FM 扫描如何驱动 BF 为 5 kHz 的兴奋性神经元（图 4d，红色曲线）。当 FM 扫描接近此 BF 时，这些神经元会接收直接前馈激励，并通过递归兴奋连接进行放大（图 4di-dii）。同时，它们会从附近的 PV 细胞受到强烈抑制，因为这些中间神经元也会接收前馈和递归激励（图 4diii）。另一方面，当 FM 扫描激发具有更高 BF 的神经元时，由于 SOM 细胞的空间广泛连接和缓慢动力学，SOM 细胞的抑制达到峰值（图 4div）。来自 SOM 细胞的这种延迟输入会抑制递归活动，并使锥体细胞和 PV 细胞的放电低于其基线水平（网络抑制）。所有这些前馈和循环输入的组合会导致发放率最初强烈增加，随后是网络抑制（图 4dv）。相反，考虑 −20 oct/s 的向下 FM 扫描，情况则类似，只是锥体细胞在前馈激发到来之前会受到 SOM 细胞的领先网络抑制（图 4d，蓝色曲线和补充图 8）。这种网络抑制会抑制循环活动，并导致兴奋性和抑制性输入的放大减弱（图 4e和补充图 9a）。因此，向上和向下方向之间的这种差异放大会导致正的 DSI（图 4f）。

我们在模型中引入的阈值非线性（与完全线性模型不同）是否需要捕捉方向选择性？通过增加兴奋性神经元的基线发放率，可以轻松消除阈值的影响，从而形成完全线性的网络模型。有趣的是，如果是这样，我们可以证明对于所有模型参数的选择，DSI = 0（参见补充文本）。这一重要见解表明，除了对适当的电路结构进行建模外，我们还必须考虑非线性神经元传递函数，以探索方向选择性的机制基础。

由于我们的模型是沿着音调拓扑组织的，因此电路关于 16 kHz 的 BF 对称。对于所有 BF < 16 kHz 的神经元，时间过程与 BF 为 5 kHz 的神经元的时间过程相似，DSI 将为正，尽管幅度取决于它们的具体位置。对于所有 BF > 16 kHz 的神经元，向上和向下的时间过程基本上是互换的（例如，向上扫描会发生领先的抑制）并且 DSI 将为负（图 4f）。我们注意到，这个结果和这些曲线的定性特征适用于各种 FM 速率，这证明我们的模型解释了在动物行为学相关速率下 FM 扫描的方向选择性（图 4g和补充图 8）。

接下来，我们将分析该模型，并找出影响 DSI 曲线形状的关键特征。我们首先通过向这些中间神经元提供超极化电流并削弱有效连接来模拟 SOM 和 PV 细胞的光失活（图 3）。失活 SOM 细胞会导致整个音调轴上的绝对 DSI 大幅降低（图 5a）。虽然领先的抑制仍然存在，但它明显较弱，不足以抑制复发性活动。因此，在向上和向下扫描期间，兴奋性输入会被放大相似的量。相反，失活 PV 细胞具有相反的效果，它会放大领先的网络抑制22，延长沉默期，并维持（如果不是加强的话）DSI（图 5b）。因此，我们的模型重现了 SOM 细胞在产生方向选择性方面的关键作用（图 3）。有趣的是，仅仅减少 SOM 细胞的空间整合和投影尺度以匹配锥体和 PV 细胞，也会消除领先的网络抑制，从而消除方向选择性 (图 5c )。这一结果强调了 SOM 细胞的广泛连接在连接 A1 电路远端频域方面的重要性。

图 5.网络模型证明了 SOM 细胞活动和强烈的循环激发的要求。a左图，在对照（黑色）和 SOM 细胞部分失活（黄色）条件下，以 ±20 oct/s FM 速率绘制 DSI 与 BF 的关系。中间，SOM 细胞部分失活期间锥体细胞（5 kHz BF）的放电率。右图，响应向上和向下 FM 方向的兴奋性突触后电荷的扩增。b PV细胞部分失活的结果。c SOM细胞连接的空间尺度减小的结果。d具有降低的循环激发强度的非ISN模型的结果。

最后，我们研究了从 ISN 状态到非 ISN 状态的转变（这种转变可能类似于从清醒状态到麻醉状态的转变（见“讨论”））对这些结果的影响。这是通过削弱锥体神经元之间的有效循环相互作用并将自发放电率降低到 0.1 Hz 来实现的。我们发现，循环连接的减弱足以推动系统在线性状态下运行并消除网络抑制和方向选择性（图 5d）。虽然因此很容易得出结论认为 ISN 动态是方向选择性的必要条件，但这尚不明显。我们的结果表明，当电路具有强循环相互作用时，电路更有可能达到非线性阈值，从而通过信号放大实现较大的动态放电率范围。尽管构建具有强循环性的稳健电路可能需要 ISN 机制29、30 ，但精心调整的非 ISN 网络有可能达到非线性阈值，尽管是在刺激参数受限的范围内。

总的来说，我们的模拟结果为 A1 中输入的非线性放大提供了理论基础，并展示了有助于产生 FM 方向选择性的三个电路元件：非线性神经元传递函数、SOM 细胞的空间广泛连接以及强大的循环连接。

2.5 A1 神经元对频率范围受限的 FM 扫描具有方向选择性

我们的研究结果说明了皮质回路机制如何塑造与行为学相关的慢速调频扫描的方向选择性。类似的机制是否能对小鼠发声中普遍存在的频谱受限调频扫描产生方向选择性（补充图 1c）？我们通过对表达 GCaMP6s 的 L2/3 锥体细胞进行成像，同时呈现覆盖一个八度频率范围的调频扫描（最低范围：4-8 kHz；最高范围：32-64 kHz；图 6a、b），对此进行了实验测试。有趣的是，我们发现许多神经元会根据调频扫描的频率范围反转其方向偏好（图 6b）。该结果表明，调频方向选择性并不是每个神经元的固定属性，而是由其 BF 与扫描频率范围之间的关系决定的。为了系统地研究这种关系，我们确定了扫描的对数中心（F分），并计算了每个神经元的 F分相对于 BF的相对位置（见图6b中的插图 ）。这为每个细胞产生了七个细胞-F分对，并且分别为这些对中的每一对计算了 DSI。正如预期的那样，当锥体细胞的 BF 在扫描频率范围内时，它们最敏感（相对 F分在 -0.5 和 0.5 之间；图 6c）。无论 FM 速率如何，绝对 DSI 值都保持较高水平，表明 A1 锥体细胞对缓慢且光谱受限的行为学相关 FM 扫描具有方向选择性（图 6d）。值得注意的是，当为相对 F分位置的箱单独计算 DSI 时，我们发现在相对 F分= 0附近 DSI 发生急剧逆转 （图 6e），我们的计算模型也捕获了这一结果（补充图 9c）。因此，神经元对 FM 扫描远离其 BF 的方向表现出偏好。这与我们使用长 4 个八度扫描获得的结果一致（图 1h），并更全面地描述了神经元的 FM 方向选择性与 TRF 之间的关系。这些数据进一步证实了我们的结论，即 A1 神经元会辨别声音通信中存在的动物行为学上真实的 FM 扫描的方向。

图 6.A1 神经元对频率范围受限的 FM 扫描具有方向选择性。a示意图显示频谱限制的 FM 扫描，频率范围为 1 个倍频程。F分，对数中心。b左图示意图显示使用的七个频率范围。绿线表示代表性细胞的 BF，其 FM 扫描响应显示在右侧。插图显示 F分转换为以 BF 为中心的相对位置。右图为代表性 L2/3 锥体细胞（BF = 9514 Hz）对七个频率范围的 FM 扫描的响应。该细胞在其 BF 处的F分周围将其方向选择性从向上偏好（红色箭头）反转为向下偏好（蓝色箭头）。c 每个相对 F分位置箱中 FM 扫描响应细胞的比例（n = 6 只小鼠，485 个成像锥体细胞中有 140 个音调响应细胞）。d每个 FM 速率下的绝对 DSI 的平均值（实线）和 SEM（阴影）（226 个扫描响应细胞）。仅包括F分在BF ±1 个八度以内的FM 扫描。e绘制了每个相对 F分位置箱的平均 DSI，显示 DSI 符号的反转（n = 25、39、58、69、60、31 个响应锥体细胞在每个 F分）。结果为平均值 ± SEM。*** p = 0.0006，** p = 0.0012，双侧t检验。

三、讨论

3.1 ISN 中的非线性计算

越来越多的清醒动物研究发现，感觉皮层起着 ISN 的作用。我们之前发现，由于 A1 中的 ISN 运作，非偏好的纯音会引起网络抑制，即复发性活动的衰减，从而导致自发 EPSC 和 IPSC 的抑制。在本研究中，我们进一步证明 ISN 中的网络抑制在产生与行为学相关的慢速 FM 扫描的方向选择性方面起着关键作用。一个简单的示意图（图 7）解释了我们的模型，关于网络抑制如何衰减非偏好 FM 扫描的 EPSC 。如前所述，网络抑制在 TRF 内是不对称分布的（图 7a、b）。我们现在将 FM 扫描建模为纯音频率按升序（向上）或降序（向下）顺序呈现（图 7c）。EPSC 的时间交错总和会导致网络抑制，该抑制是领先于激发还是紧随其后，具体取决于扫描的方向（图 7d）。由于其动力学缓慢，滞后网络抑制不会影响领先激发（图 7d，左）。相反，领先网络抑制与滞后激发重叠并减弱复发性活动（图 7d ，右）。由于皮质复发回路将前馈丘脑输入放大 2-5 倍，复发活动的衰减会严重降低声音诱发的 EPSC。这种对非优先方向放大的阻断会在方向之间产生电荷不对称。该模型成功解释了 DSI 的 BF、速率和频率范围依赖性（补充图 10）。尽管由于声音的快速动态，纯音的顺序呈现在实验上具有挑战性，但我们的网络模拟（图 4、5 ）捕捉到了这些机制并识别了关键的电路元件。重要的是，我们的模型阐明了由于网络抑制的长期动力学，与行为学相关的慢速 FM 扫描的方向选择性得到增强。这与仅考虑快速前馈输入的经典模型形成对比。我们的结果表明考虑循环电路的非线性动力学非常重要，这扩展了单个神经元随时间整合信息的能力。

图 7.通过网络抑制产生方向选择性的简单示意图。a 代表性细胞中的 EPSC 的TRF。轨迹是三次试验的平均值。红线勾勒出具有快速 EPSC 的区域，蓝线表示具有慢速网络抑制的区域。b具有低BF的神经元从高频侧接收网络抑制，而具有高 BF 的神经元从低频侧接收网络抑制（n = 14 个细胞，p = 0.0018，双侧t检验）。c一个声音水平下的 EPSC 的 TRF 示意图。FM 扫描可以近似为纯音的顺序呈现。插图显示了皮质循环电路对丘脑输入的放大。d示意图说明了低 BF 神经元中向上偏好的产生。顶部，来自（c）的纯音响应在时间上交错，以解释 FM 扫描期间的频率运动。底部，由向上和向下的音调序列产生的复合 EPSC。在首选方向上，快速 EPSC 先于网络抑制，从而导致基本上线性的总和（红色轨迹）。在非优先方向上，网络抑制与快速 EPSC 重叠并使其减弱，导致亚线性求和（蓝色轨迹）。底部的深色轨迹显示线性求和，方向之间的总电荷相等。

许多空间分布的皮质模型认为神经元分布在周期域上，这是受视觉系统中的方向选择性驱动的。这提供了一种网络对称性，其中所有神经元的输入都分布在相同的空间尺度上。在我们的模型中，声音定位组织不在周期域上，空间尺度在声音定位位置上变化——具有低（高）BF 的神经元在声音定位轴的低（高）频侧具有较短空间尺度的输入。由于这种对称性的破坏，所有神经元都会接收在声音定位上具有不同空间足迹的输入。然后，广泛的输入会驱动独特的时空整合模式，并赋予单个神经元不同的方向选择性。因此，在模拟皮质对复杂刺激的反应时，考虑适当的空间约束至关重要。

3.2 初级听觉皮层的方向选择性

尽管之前的研究发现 FM 方向选择性与 TRF 内“边带抑制”的不对称性之间存在相关性，但这种关系背后的突触机制仍然存在争议。我们现在证明，解释清醒 A1中边带抑制的网络抑制不是通过前馈输入之间的时间偏移来产生 FM 方向选择性，而是通过衰减循环电路介导的兴奋性输入放大来产生。我们的结果不仅与边带抑制的贡献一致，而且与先前关于抑制神经元作用的发现一致，包括加巴嗪输注降低方向选择性、 PV 细胞光失活对方向选择性没有影响，以及 SOM 细胞在触发网络抑制中的作用。因此，我们提出的模型解决了之前的争议，并为边带抑制如何在循环网络中塑造方向选择性提供了更新的电路基础。但是，我们不排除我们的模型与其他产生方向选择性的机制结合使用的可能性。例如，在突触后电荷的实验测量和基于模型的预测中，我们都观察到极低（2.5 oct/s）和高（80-160 oct/s）FM 速率下的方向选择性相对较低，这些结果偏离神经元放电的 DSI 与 FM 速率之间更平坦的关系。我们还观察到 DSI 的局部异质性，尤其是在扫描反应较弱的细胞中，这无法用我们的一维 A1 模型来解释。这些条件下的方向选择性可以部分归因于其他机制，例如 ON 和 OFF 反应之间的延迟和比较、组合敏感的超线性求和、强度斜坡选择性放电（见补充文本）以及从上游结构的继承（见下文）。

我们的 SOM 细胞光失活实验证明了皮质内对慢速 FM 扫描的方向选择性增强。相比之下，先前的研究仅在极快的 FM 速率（约 70 oct/s 或 0.5-3 kHz/ms）下观察到方向选择性，并提出突触后电荷中存在的方向选择性只是从丘脑遗传而来。为什么先前的研究没有看到较慢 FM 扫描的方向选择性增强？我们认为清醒状态和麻醉状态之间电路特性的两个关键差异可能导致了这些结果。首先，已知麻醉会减弱皮质 SOM 细胞的活性。由于我们的光遗传学失活证明了 SOM 细胞在塑造方向选择性方面发挥着关键作用，因此麻醉下其活性的缺失可能只是降低了方向选择性。其次，麻醉会抑制许多神经回路的活动，使神经元的放电阈值远低于其放电阈值。理论研究指出，随着回路活动水平的降低，网络可以从 ISN 切换到非 ISN 。事实上，最近的研究表明，在清醒动物的静息状态下，初级感觉皮层表现为 ISN，而深度麻醉下的 V1 则表现为非 ISN。因此，先前研究中麻醉大脑的非 ISN 操作可能阻止触发网络抑制，而网络抑制的慢动力学对于产生方向选择性至关重要。我们的理论模型支持这两种可能性，通过证明 SOM 细胞活动的去除和复发性兴奋（非 ISN）的衰减都会降低方向选择性。此外，与麻醉状态相比，我们在清醒状态下观察到的方向选择性增强的 FM 速率范围与我们的模型一致（图 4g和补充图 2）。总体而言，我们的数据支持以下观点：清醒大脑中的 A1 回路积极塑造神经元对行为学相关 FM 扫描的调谐，而循环回路在此计算中起着关键作用。因此，通过非线性循环动力学进行的感觉整合可能是清醒大脑皮层活动的一般特征。

3.3 调频方向选择性的皮质和皮质下来源

FM 方向选择性发放此前已在皮层下听觉结构中观察到，包括耳蜗核、下丘、和丘脑。特别是，下丘的方向选择性已在蝙蝠中得到广泛研究，因为它与蝙蝠的回声定位和通信有关，并且它的产生被认为涉及前馈突触输入之间的时间偏移。因此，尽管我们证明了 SOM 细胞介导的皮质增强了 FM 方向选择性，但 A1 中的部分方向选择性很可能是从上游外周结构8遗传的。这个想法与我们在 SOM 细胞失活后观察到的残余方向选择性一致（图 3g），并且从上游和循环电路介导的增强的继承都与 FM 扫描引起的突触后电荷的不对称性相兼容（图 2）。事实上，在我们的网络模型中为前馈兴奋输入分配中等程度的 FM 方向选择性支持了皮质和皮质下机制的方向选择性的加性（补充图 9d-g）。

感觉外围的神经元计算如何有助于皮质信息处理，这一问题在感觉模式中一直存在争议。与我们在听觉系统中的发现类似，视觉系统的方向选择性的产生均已在皮质和外围视网膜57中得到报道。之前的研究中，方向选择性视网膜神经节神经元的消融仅部分降低了初级视觉皮质的方向选择性，表明外围和皮质机制均有附加贡献。有趣的是，这种视网膜扰动主要影响高速视觉运动（40º/s）下的皮质反应，这表明皮质机制主要增强低速到中速的视觉运动处理。同样，我们在网络模型中发现，在高速 FM 扫描中，A1 回路内 FM 方向选择性的增强不太明显（图 4g）。因此，外围和皮质对快速和慢速时变刺激的互补提取（这可能与皮质层面快速变化刺激的忠实编码丧失有关）可能是所有感觉模态共有的一般特征。阐明皮质如何从外围继承和转换各种感觉信息并扩展编码能力将是理解皮质计算的关键步骤。

3.4 对语音通信中 FM 扫描处理的影响

听觉皮层对于行为辨别 FM扫描方向必不可少。因此，为了理解发声中 FM 扫描触发的感知行为，确定 FM 方向信息如何映射到皮层群体活动非常重要。除了一些例外，大多数关于 FM 方向选择性的研究都使用了长扫描，其频率几乎覆盖了小鼠听觉的整个范围（3-5 个八度）。由于这种声音设计，这些研究为每个细胞分配了一个 DSI 值，并且方向选择性已在拓扑上映射到 A1 音调轴上，因此低 A1 更喜欢向上扫描，而高 A1 更喜欢向下扫描（但在另一项研究中则相反）。相比之下，我们使用了具有受限频率范围（ 1 个八度）的动物行为学上更真实的 FM 扫描，并发现方向选择性不是每个神经元的固定属性，而是根据 FM 扫描相对于神经元 BF 的相对位置而变化。这种频率依赖性方向选择性比固定方向选择性具有明显的行为学优势。在后一种系统中，高 A1 神经元主要对向下扫描作出反应，可能无法检测到小鼠超声波发声中大量出现的向上扫描（图 1）。相反，在具有频率依赖性方向选择性的系统中，即使在极高或极低频域中，FM 扫描也可以编码而不会丢失信息，因为每个神经元都参与了向上和向下 FM 扫描的表示。结合我们对行为学相关的慢速 FM 扫描的方向选择机制的展示，我们的研究结果表明，清醒小鼠的 A1 神经元能够编码发声中 FM 扫描传达的丰富信息。由于慢速 FM 扫描的方向为人类的音位识别63和词汇区分64提供了关键线索，我们的研究结果为了解更复杂的人类大脑中声音通信的神经回路迈出了一步。

四、方法

4.1 动物

实验时小鼠至少有 6 周大。小鼠来自 Jackson Laboratories（VGAT-Cre、SOM-Cre、PV-Cre、ROSA-LSL-tdTomato、C57BL/6J、CBA/J 和 BALB/cJ）或 Charles River Laboratories（C57BL/6J、CBA/J 和 BALB/cJ）。雌性和雄性动物均被使用并饲养在反向光照周期（12h-12h）中。所有实验均在黑暗周期内进行。所有程序均符合北卡罗来纳大学教堂山分校和大阪大学的机构动物护理和使用委员会以及美国国立卫生研究院的指导方针。

4.2 小鼠发声记录

录音来自 C57BL/6J、BALB/cJ 和 CBA/J 品系。雄性求偶歌曲和幼崽隔离叫声在定制的隔音室中录制，使用录音软件 Avisoft-RECORDER，采样率为 250 kHz，麦克风（CM16/CMPA）和前置放大器。麦克风放置在笼子底部 9 厘米处。将雌性小鼠放入同一笼子内可触发雄性小鼠的求偶歌曲。幼崽与母亲隔离时发出的幼崽叫声在 8-10 天大时被记录下来。疼痛发声在隔音室中记录，使用自定义 Matlab 代码进行记录，采样率为 500 kHz，麦克风 (4939-A-011) 和调节放大器。麦克风放置在头部固定的小鼠上方 5 厘米处。疼痛发声由尾部轻微电击 (0.5-0.8 mA，0.5-1 秒) 触发。

4.3 内在信号成像

使用定制的串联镜头宏观显微镜和 12 位 CMOS 相机 (DS-1A-01M30，Dalsa) 获取内在信号图像。首先为所有小鼠植入定制的不锈钢头杆。用氧气 (1 L/min) 蒸发的异氟烷 (0.8–2%) 对小鼠进行麻醉，并将其放在 34–36 °C 的反馈控制加热垫上。移除覆盖右听觉皮层的肌肉，并使用牙科水泥将头杆固定在头骨上。用磷酸盐缓冲盐水浸透头骨以保持透明。在成像之前，给小鼠皮下注射氯普噻吨 (1.5 mg/kg)。使用绿色 LED 照明 (530 nm) 获取表面血管图像，并使用红色照明 (625 nm) 记录内在信号 (16 Hz)。每次试验由 1 秒基线、1 秒声音刺激（75 dB 纯音，频率为 3、10 或 30 kHz，每个频率 10-20 次试验）和 30 秒试验间隔组成。反射图像以 717 × 717 像素（覆盖 2.3 × 2.3 毫米）采集。对反应期内（声音开始后 0.5-2 秒）的图像取平均值，然后除以基线期间的平均图像。对各试验的图像取平均值，进行高斯滤波，并设置阈值以进行可视化。根据其特征性的声音定位组织，识别出包括 A1、前听觉场 (AAF)、腹侧听觉场 (VAF) 和次级听觉皮层 (A2) 在内的各个听觉区域。

4.4 双光子钙成像

在VGAT-Cre × Rosa-LSL-tdTomato小鼠中使用内在信号成像映射听觉皮层区域后，在听觉皮层上进行开颅手术 (2 × 3 mm)，保持硬脑膜完好无损。钻孔每 1-2 秒中断一次，并用 PBS 冷却头骨以防止过热损坏。在 5-10 个位置注射病毒 (AAV9.syn.GCaMP6s.WPRE.SV40)（距离软脑膜表面 250 μm 深，30 nL/位，10 nL/min）。在开颅手术上放置玻璃窗并用牙科水泥固定。开颅手术前注射地塞米松 (2 mg/kg)。在将小鼠放回笼子前注射恩诺沙星 (10 mg/kg) 和美洛昔康 (5 mg/kg)。在慢性窗口植入后 2-3 周进行双光子钙成像，以确保 GCaMP6s 表达水平适当。在钙成像前 1-3 天通过慢性窗口进行第二次内在信号成像，以确认听觉皮层图完整。在钙成像当天，将小鼠头部固定在清醒状态下，置于定制的消音室中的双光子显微镜下。对纯音和 FM 扫描的响应通常在两个单独的成像会话中测量，两个会话中成像的细胞为 59.3 ± 6.3%。GCaMP6s 和 tdTomato 在 925 nm（InSight DS +，Newport）下激发，并使用运行 Scanimage 软件（Vidrio）的商用显微镜（MOM 示波器，Sutter）以 30 Hz 的频率使用 ×16 物镜（Nikon）获取图像（512 × 512 像素，覆盖 620 × 620 μm）。图像是从 L2/3（表面以下 200-300 μm）采集的。通过基于互相关的图像对齐65来校正横向运动。通过在 Wavesurfer 软件（Vidrio）中记录定时 TTL 信号，将声音传递的时间与成像帧对齐。每次成像之前，通过获取绿色和红色通道中的图像来识别 tdTomato 表达细胞。显示示例视野的图表面板（图 1c）是通过使用 Fiji 软件叠加来自两个通道的信号生成的。

4.5 体内电生理学手术

用内在信号成像映射听觉皮层区域后，用硅酮弹性体覆盖暴露的头骨。一到五天后，用异氟烷麻醉小鼠，除去硅酮盖露出头骨。在 A1 上方行小面积（直径 <0.3 毫米）开颅手术，并在大多数实验中行硬膜切开术。在手术过程中，我们特别注意减少对脑组织的损伤，因为我们观察到受损组织有异常活动。我们发现每隔 1-2 秒中断钻孔并用人工脑脊液（aCSF，以 mM 为单位：142 NaCl、5 KCl、10 葡萄糖、10 HEPES、2-2.5 CaCl 2、1-1.3 MgCl 2，pH 7.4）冷却头骨至关重要，以防止过热造成损伤。用 aCSF 覆盖开颅手术部位，小鼠在进行电生理记录前至少从麻醉中恢复 1.5 小时。

4.6 体内全细胞记录

开颅和硬膜切开术后恢复后，将小鼠头部固定在清醒状态。记录期间，小鼠静静地坐在隔音罩内松散安装的塑料管中（偶尔拂动和梳理毛发）。采用盲法进行全细胞膜片钳记录。所有记录的细胞均位于 L2/3，基于MP-285 微操作器（Sutter；距离软脑膜表面 170–330 μm）的z轴读数。使用膜片吸液管（3.5-5 MOhm）进行电压钳记录，吸液管内充满油（单位：mM）130 葡萄糖酸铯、10 HEPES、5 TEA-Cl、12 磷酸肌酸钠、0.2 EGTA、3 Mg-ATP 和 0.2 钠-GTP（pH 值为 7.2；310 mOsm）组成的内部溶液。EPSC 和 IPSC 分别在 −70 mV 和 +20 mV 处记录，接近我们内部溶液设定的抑制和激发反转电位。膜电位值未针对 15 mV 液体连接电位进行校正，并连续监测串联电阻的稳定性（平均 26.4 ± 3.0 MOhm，n = 9 个细胞）。使用 MultiClamp 700B进行记录，以 10 kHz 进行数字化，并使用 pClamp 软件获取。

在清醒小鼠中，我们观察到连续不断的自发性 EPSC 和 IPSC。仅在受损制剂（例如出血的脑组织、钻孔过程中过热的组织或过多的电极穿透）中观察到低基础活动和间歇性爆发。由于网络抑制的检测主要依赖于完整的自发活动22的存在，因此未对有手术损伤的小鼠进行记录。在 5-10 次移液器穿透后，当现场 EPSP 记录中出现爆发性活动时，实验终止。

4.7 单位记录过程中的体内光遗传学失活

为了灭活特定的中间神经元亚型，将 AAV2/9.EF1a.DIO.eNpHR3.0.EYFP.WPRE.hGH 注射到新生SOM-Cre或PV-Cre小鼠（出生后第 1-2 天）的右侧听觉皮层中。幼崽通过低温麻醉并固定在模制平台中。病毒注射在听觉皮层喙-尾轴的三个位置。在每个部位，注射深度为三个（距离皮肤表面 1000、800 和 600 μm，23 nL/深度）。注射六周后，如上所述进行开颅术和硬脊膜切开术。手术恢复后，将小鼠头部固定在清醒状态。记录过程中，小鼠静静地坐在（偶尔拂动和梳理毛发）松散的塑料管中，该塑料管位于隔音罩（Gretch-Ken Industries 或定制）内。对于麻醉下的单位记录，在记录前给小鼠注射 1.5 g/kg 氨基甲酸酯和 1.5 mg/kg 氯普噻吨，并在整个实验过程中使用反馈控制加热垫将体温维持在 36.0 °C。将 64 通道硅探头（ASSY-77-H3，削尖）插入 A1。让探头静置至少 1 小时后再收集数据。单位活动被放大、数字化（RHD2164，Intan Technologies），并使用 OpenEphys 系统以 20 kHz 采集。光纤耦合 LED（595 nm）位于变薄的头骨和小开颅手术上方 1-2 毫米处。在交错试验中，LED 照明持续从声音开始前 500 毫秒到声音结束后 300 毫秒。由于我们发现抑制性神经元的过度失活会导致声音触发反应的矛盾消除，并且通常会不可逆地将皮质活动改变为突发状态，因此 LED 强度保持在最低有效强度（大脑表面 1-3 mW/mm 2）。在开始测量每只小鼠的声音诱发反应之前，我们在施加短暂的 LED 照明的同时监测了没有声音刺激的自发活动，从低强度开始，逐渐增加强度。我们确定了导致自发活动明显增加的最低有效强度，并将其用于 FM 扫描实验。为了确保 SOM 和 PV 细胞失活之间的光遗传学效应相似，并防止皮质活动发生不可逆变化，在 LED 照明期间自发放电率增加 25-100% 的实验是可以接受的。

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4.8 声音刺激

听觉刺激在Matlab 中计算并通过自由场静电扬声器 (ES1) 传送。扬声器在 2–64 kHz 范围内校准，以提供平坦响应 (±1 dB)。以不同的速率 (2.5、5、10、20、40、80、160 八度/秒) 呈现向上 (4–64 kHz) 和向下 (64–4 kHz) 对数 FM 扫描。在图 6的实验中，以相同的 FM 速率生成一个八度的 FM 扫描 (F音分在 5.7、8、11.3、16、22.7、32、45.3 kHz)。声音刺激在开始和结束处具有 3 毫秒的线性上升-下降。刺激被传送到成像或记录位置对侧的耳朵。听觉刺激传递由在 Matlab 上运行的 Bpod（Sanworks）控制。

4.9 小鼠发声的调频频率分析

使用自定义 Matlab 代码从录制的发声中提取音节。如果绝对振幅超过基线噪声的 10 × SD，则检测到音节。使用 5 × SD 的标准确定音节的起始和结束，并以 15 毫秒的边距将音节分离出来。通过对频谱图进行图像处理，将发声信号的轮廓与背景噪声分离。为了分析雄性求偶歌曲和幼崽隔离叫声，每个音节的频谱图以 0.5 毫秒的时间分辨率生成。提取每个音节中功率高于最大值 25%（对于雄性歌曲）或 20%（对于幼崽叫声）的像素作为信号。为了分析痛苦发声，对于 B6 和 BALB/c，每个音节的频谱图以 1 毫秒的时间分辨率生成，对于 CBA，以 0.5 毫秒的时间分辨率生成。对于每个时间段，通过在频域中减去移动平均值（4000 Hz 窗口）来去除宽带成分。通过应用中值滤波器（3 × 3 像素）进一步平滑频谱图。使用 Frangi 滤波器增强了轮廓的连续性。提取每个音节中功率高于最大值 5% 的像素作为信号。提取发声信号的轮廓后，使用洪水填充算法分离音节内的各个连续成分（补充图 1）。为了进一步降低噪音，短于 3 毫秒（雄性歌曲和幼崽叫声）或 7 毫秒（痛苦发声）的音节成分被丢弃。从像素位置获得各个成分的时间和频率值。每个成分进一步划分为 5 毫秒段，并计算各个段的 FM 速率。

4.10 双光子钙成像数据分析

Suite2P 软件自动检测与单个细胞体相对应的感兴趣区域 (ROI)，并通过手动绘制进行补充。但是，我们在 ROI 检测后没有使用 Suite2P 中的分析管道，因为我们经常观察到背景信号的过度减法。使用 Matlab 中的自定义图形用户界面单独检查和编辑所有 ROI 以获得适当的形状。使用 ROI 位置的仿射变换跨天对齐 ROI，如果区域重叠超过 60%，则判断两天的 ROI 为同一细胞。此外，使用自定义图形用户界面目视检查单个 ROI 是否对齐。对每个 ROI 内的像素取平均值以创建荧光时间序列 F cell_measured (t)。为了校正背景污染，在每个细胞 ROI 周围创建了环形背景 ROI（从 ROI 边界 2 个像素开始到 8 个像素结束）。从这个背景 ROI 中，排除了包含周围细胞的细胞体或突起的像素。对剩余像素取平均值以创建背景荧光时间序列 F背景(t)。细胞体的荧光信号估计为 F(t) = F细胞测量值(t) – 0.9 × F背景(t)。为确保可靠的神经纤维网减法，仅包括比背景 ROI 亮至少 3% 的细胞 ROI。在音调开始后的 1.2 秒窗口内测量纯音调响应。考虑到 GCaMP6 的缓慢动力学，从声音开始到声音偏移后 0.3 秒测量 FM 扫描响应。如果细胞满足两个标准，则判断为显著兴奋：(1) 在超过一半的试验中，dF/F 必须连续超过固定阈值至少 0.5 秒。(2) 跨试验平均的 dF/F 必须连续超过固定阈值至少 0.5 秒。通过受试者工作特征 (ROC) 分析确定了兴奋阈值（基线期间为 3.3 × 标准差），从而在音调反应中产生 90% 的真阳性率。通过比较血管模式，将双光子成像场与内在信号成像场对齐。总体而言，40% 的 GCaMP6s 表达锥体细胞（n = 1176 个细胞，8 只小鼠）在响应至少一种频率时活动增加。BF 被计算为具有最强响应的频率，与音调强度无关。

方向选择性是使用至少五次呈现每种声音刺激的试验中的平均 dF/F 轨迹来确定的。DSI 计算为 (U−D)/(U + D)，其中 U 表示由向上 FM 扫描触发的响应幅度，D 表示由向下 FM 扫描触发的响应幅度。对于每个 ROI，仅使用在至少一个方向上引起显著兴奋反应的 FM 速率来计算 DSI。响应幅度计算为响应测量窗口期间的平均 dF/F 值，并将负幅度强制为零以保持 DSI 范围在 −1 和 1 之间。响应幅度在向上或向下方向内的所有包含的 FM 速率中取平均值，以计算每个 ROI-FM 范围对的单个 DSI 值，但对不同 FM 速率的 DSI 单独计算的分析除外。由于我们的阈值产生 90% 的真阳性率，不可避免地会产生假阳性显着反应，因此我们在分析中仅包括对至少三种声音有显着反应的 ROI。这大大减少了随机波动引起的自发显著响应的污染，同时在很大程度上保留了真实响应，因为具有强响应的神经元通常会对多种声音做出响应。我们还纳入了具有较低阈值（包括所有响应 ROI：补充图 4b）和较高阈值（包括对至少五种声音有显著响应的 ROI：补充图 4d）的结果，以便比较数据选择标准之间的 DSI 局部异质性。

4.11 体内全细胞记录数据分析

使用 Matlab 中的自定义程序分析数据。响应幅度根据每个声音刺激的 3-9 次试验的平均轨迹进行量化。对于纯音 (100 毫秒) 响应，起始锁定 EPSC (IPSC) 在音调开始后 15-40 毫秒测量为负 (正) 电流，网络抑制在音调开始后 50-175 毫秒测量为正 (负) 电流。如果细胞满足两个标准，则判断它们对特定的频率和强度组合有反应：(1) 在超过一半的试验中，轨迹连续超过固定阈值 (1 × 基线标准差) 至少持续检测窗口持续时间的一半，以及 (2) 试验间的平均轨迹连续超过阈值至少持续检测窗口持续时间的一半。起始锁定 EPSC 和网络抑制的 BF 被确定为引起最强响应的频率。对于 FM 扫描 (25–1600 ms) 响应，为了将快速突触电流与重叠的慢速网络抑制隔离开来，首先通过使用迭代过程平滑轨迹的非活动部分来估计网络抑制的轨迹。当试验平均轨迹在基线期间偏离估计的网络抑制轨迹超过 3 × 标准差时，检测到快速 EPSC 和 IPSC。一旦检测到快速事件，在自动检测轨迹峰值和波谷的图形用户界面的帮助下，以盲法手动确定电流的开始和偏移。兴奋性 (抑制性) 电荷计算为连接事件开始和偏移的线下方 (上方) 的面积。当在单个轨迹内检测到多个事件时，将电荷加在一起，但是，峰值和开始的时间是根据电荷最大的事件计算的。EPSC-IPSC 时间偏移仅在细胞声音对中计算，其中 EPSC 和 IPSC 轨迹中都有相应的检测事件。DSI 值的计算方式与双光子钙成像实验相同，但考虑到电生理学的更快动力学，仅在扫描偏移后 50 毫秒内包括电荷（音调诱发电流的平均半最大持续时间，EPSC：54.4 ± 8.8 毫秒；IPSC：48.9 ± 6.5 毫秒）。

4.12 单体记录数据分析

使用 Kilosort 软件和尖峰分类图形用户界面分离单元。根据尖峰间隔直方图（校正整体尖峰频率后，2 ms 区间内尖峰的 <3%）和尖峰波形的一致性确认单元分离。通过电流源密度分析和多单元尖峰的分布确定皮质表面、层和白质的位置。根据快速尖峰单元的小谷峰间隔（<0.4 ms）进行识别。为了量化 FM 扫描诱发的反应，在 50 ms 区间生成 PSTH。在减去声音开始前 0-200 ms 的基线发放率后，对声音诱发的反应进行量化。因此，声音诱发的反应不包括 LED 引起的自发发放率的增加。如果满足两个标准，则判定单元显著兴奋：（1）PSTH 必须在超过三分之一的试验中在同一时间段内超过固定阈值。（2）试验平均 PSTH 必须超过固定阈值。通过 ROC 分析确定兴奋阈值（LED 前基线期间的 3.7 × 标准差），以在音调诱发反应中产生 90% 的真阳性率。DSI 值的计算方式与全细胞记录实验相同。

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